摘要
老年人對(duì)具有良好生物相容性和持久性的面部填充劑有很高的需求，以克服面部凹陷。采用甲基丙烯酸縮水甘油酯修飾的絲素水凝膠打印新型可注射再生絲素(RSF)微粒來解決這個(gè)問題。RSF水凝膠的β-片含量和力學(xué)性能可以通過凍融循環(huán)次數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)，RSF水凝膠在鹽水中的溶脹率可以忽略不計(jì)。打印的RSF微粒均勻，直徑約為300-500 μm，可以通過打印屏幕的孔徑進(jìn)行調(diào)節(jié)。用26號(hào)針注射后，RSF微粒的尺寸分布沒有明顯變化，說明微顆粒在注射過程中能夠承受剪切應(yīng)變而不破裂。體外實(shí)驗(yàn)表明，RSF不僅具有良好的生物相容性，而且有利于成纖維細(xì)胞的遷移。皮下注射實(shí)驗(yàn)表明，RSF微粒在注射部位形成持久的隆起。組織切片顯示，第8周RSF微粒仍然明顯，微粒周圍形成血管。這些數(shù)據(jù)表明，打印的RSF微粒在面部年輕化方面具有巨大的潛力。
研究?jī)?nèi)容
蠶繭在脫膠后溶解于溴化鋰溶液中1 h。將GMA倒入溶液中，在60℃下攪拌6 h。反應(yīng)結(jié)束后，透析并冷凍干燥。冷凍干燥的GMA-SF在室溫下溶解得到濃度為30%的溶液，加入光引發(fā)劑，然后將混合物轉(zhuǎn)移到模具中，用波長(zhǎng)為365 nm的紫外光照射光固化，制備RSF水凝膠。對(duì)水凝膠進(jìn)行不同的凍融循環(huán)處理，以調(diào)節(jié)β-片的含量。使用不銹鋼篩網(wǎng)對(duì)其進(jìn)行過篩。
圖1 RSF水凝膠微粒的制備及其作為注射填料的應(yīng)用示意圖。
圖2A-D所示，制備的4種不同凍融周期的RSF水凝膠的透明度與循環(huán)次數(shù)成反比。SEM圖像（圖2E-H）顯示，所有水凝膠都具有均勻且相互連接的多孔結(jié)構(gòu)。采用壓汞法定量測(cè)定了RSF水凝膠的孔隙度和孔徑分布。從圖2I可以看出，經(jīng)過凍融處理的RSF水凝膠的平均孔徑大于FT-0水凝膠的平均孔徑，與SEM結(jié)果一致。4種不同凍融孔隙率差異不大，說明凍融對(duì)RSF水凝膠孔隙率無明顯影響。通過XRD分析對(duì)RSF水凝膠的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)價(jià)（圖2J）。FT-0在20°左右出現(xiàn)一個(gè)加寬的峰，表明β-片的含量較低。相比之下，經(jīng)過凍融處理的RSF水凝膠的XRD有很大不同。這些水凝膠分別在16.7°和22.8°處有2個(gè)衍射峰。圖2K采用拉曼光譜對(duì)樣品進(jìn)行表征，結(jié)果顯示，F(xiàn)T-1、FT-2和FT-3的β-折疊對(duì)應(yīng)的峰位于1663 cm-1和1236 cm-1。如圖2M-P所示，當(dāng)凍融循環(huán)次數(shù)從0次增加到3次時(shí)，水凝膠中β-折疊結(jié)構(gòu)的含量從15.6%增加到32.9%，這證實(shí)了RSF水凝膠中β-折疊的含量可以通過凍融方法進(jìn)行調(diào)節(jié)。圖2Q和圖R所示，所有RSF水凝膠均呈現(xiàn)穩(wěn)定的水凝膠狀態(tài)，且在測(cè)試范圍內(nèi)，存儲(chǔ)模量(G′)始終大于損耗模量(G″)。
圖2 GMA-SF水凝膠的物理化學(xué)表征。
溶脹會(huì)影響RSF水凝膠的力學(xué)性能和可注射性，圖3B所示，溶脹5h后，F(xiàn)T-0的溶脹率分別為81.4%(水中)、18.7% (PBS中)和20.1%(生理鹽水中)。當(dāng)延長(zhǎng)至14 d時(shí)，水凝膠的溶脹達(dá)到平衡。RSF水凝膠在去離子水中的溶脹率明顯高于在PBS和生理鹽水中的溶脹率。圖3D可知，F(xiàn)T-0、FT-1和FT-2在生理鹽水中5 h后的溶脹率分別約為20.1%、8.5%和6.8%，當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)至14 d時(shí)（圖3E），F(xiàn)T-0、FT-1和FT-2在生理鹽水中的溶脹率分別約為46.1%、1.6%和2.2%。圖3L評(píng)估了RSF水凝膠在鹽水中水化后的壓縮應(yīng)變-應(yīng)力曲線，溶脹后RSF水凝膠的可壓縮性略有下降，但仍能承受60%的壓應(yīng)變而不斷裂，說明溶脹后的RSF水凝膠仍可用于注射。
圖3 (A)水凝膠的溶脹示意圖。(B-C) FT-0在不同溶液中0-5 h和1-14天的溶脹率。(D、E) FT-0、FT-1、FT-2在生理鹽水中0 ~ 5 h、1 ~ 14 D溶脹率。(F-H) FT-0、FT-1和FT-2在生理鹽水中1個(gè)月后的FTIR光譜。(I-K) FT-0、FT-1和FT-2在生理鹽水中2個(gè)月后的FTIR光譜。(L)溶脹FT-0、FT-1和FT-2的壓縮應(yīng)變-應(yīng)力曲線。
RSF水凝膠應(yīng)切割成微粒，以適合26號(hào)針頭(內(nèi)徑= 260 μm)推注，如圖4A所示。圖4B的顯微鏡圖像顯示，過篩后的顆粒直徑相似。微顆粒在注射過程中是否破裂是真皮填充劑的一個(gè)重要指標(biāo)，因?yàn)檫@些碎片很容易被流動(dòng)的體液帶走或被免疫細(xì)胞吞噬，對(duì)填充劑有害。因此，通過顯微鏡和DLS來評(píng)估注射微粒的大小。圖4D顯示，所有注入的顆粒的直徑都在幾百微米左右，沒有觀察到明顯的斷裂。圖4E顯示，注入顆粒仍具有均勻的尺寸分布。
圖4 (A)制備打印RSF水凝膠微粒示意圖。(B)孔徑為150 μm的篩網(wǎng)打印的FT-0、FT-1和FT-2微粒的顯微鏡圖像。比例尺= 200 μm。(C)孔徑為150 μm的篩網(wǎng)打印的FT-0、FT-1和FT-2微粒的粒徑分布曲線。(D) 26號(hào)針注射后FT-0、FT-1和FT-2微粒的顯微鏡圖像。比例尺= 200 μm。(E) 26號(hào)針注射后FT-0、FT-1和FT-2微粒的粒徑分布曲線。
采用活/死染色和MTT法檢測(cè)RSF水凝膠微粒的細(xì)胞毒性。如圖5A所示，L929細(xì)胞以綠色熒光(活細(xì)胞)為主，幾乎沒有觀察到代表死細(xì)胞的紅色熒光，說明共孵育不會(huì)導(dǎo)致L929細(xì)胞死亡。圖5B為孵育24 h后的細(xì)胞活力。當(dāng)RSF水凝膠微粒濃度低于9 mg/mL時(shí)，細(xì)胞活力大于80%。活/死染色數(shù)據(jù)和MTT試驗(yàn)確定所有RSF水凝膠微顆粒具有理想的生物相容性。抓痕實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證RSF水凝膠微粒促進(jìn)L929的遷移。圖5C顯示，F(xiàn)T-0、FT-1和FT-2在24 h和48 h都顯著地刺激了L929向劃痕區(qū)域的遷移。這些數(shù)據(jù)表明，RSF水凝膠微粒可能促進(jìn)成纖維細(xì)胞向注射部位遷移，從而有利于膠原纖維的沉積。
圖5 體外定量和定性粘附試驗(yàn)。
將RSF水凝膠微粒(300 mg)分散于0.3%透明質(zhì)酸溶液(1 mL)中，皮下注射大鼠背部。0.3%玻尿酸的大鼠設(shè)為對(duì)照組。用數(shù)碼相機(jī)記錄注射部位，并在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)(2、4、6、8周)獲得大鼠體重。如圖6B所示，各組大鼠在注射后立即形成直徑為20 mm的隆起。值得注意的是，對(duì)照組的隆起在2周后完全消失。而FT-0、FT-1和FT-2組的隆起仍然明顯，大小減小到10 mm左右。當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)到4、6和8周時(shí)，F(xiàn)T-0、FT-1和FT-2組的斑點(diǎn)僅略有縮小。圖6C中相應(yīng)的隆起體積半量化也表現(xiàn)出類似的趨勢(shì)。
圖6 (A)皮下注射實(shí)驗(yàn)示意圖。(B)大鼠皮下注射0、2、4、6、8周后的照片。(C) 0-8周注射部位的剩余隆起體積(n = 3)。(D)注射實(shí)驗(yàn)期間大鼠體重變化(n =3)。
如圖7A所示，在對(duì)照組的組織切片中未觀察到任何注射劑，這與圖6B中消失的隆起相吻合。相比之下，在其他組中可以看到微顆粒。此外，RSF水凝膠微粒的大小隨著時(shí)間的延長(zhǎng)沒有明顯的變化，微顆粒沒有破裂，表明其體內(nèi)降解率相對(duì)較低。通過CD31熒光染色檢測(cè)斑點(diǎn)組織中新形成的血管。如圖7B所示，大量細(xì)胞(藍(lán)色為DAPI)聚集，F(xiàn)T-0、FT-1和FT-2組細(xì)胞中出現(xiàn)了明顯的空洞，說明微粒被細(xì)胞包裹。CD31的紅色熒光也很顯著，證實(shí)了新形成的血管的存在。相應(yīng)的CD31定量(圖7C)顯示，注射2周后，CD31的相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為5.8、29.8、43.8和47.1，在第8周增加到9.3、53.1、58.4和68.7，證實(shí)FT-0血密度，F(xiàn)T-1和FT-2顯著高于對(duì)照組。
圖7 (A)皮下注射2、4、6和8周后隆起內(nèi)的H&E染色組織。比例尺= 500 μm。(B)皮下注射2、4、6、8周后隆起內(nèi)熒光染色(CD31)組織。比例尺= 200 μm。(C)血管密度定量(n = 3)。
結(jié)論
大塊的RSF水凝膠可以很容易地打成微粒，以制備具有持久影響和普遍成本的生物相容性面部填充物。所得RSF水凝膠微粒具有均勻的粒徑分布和良好的力學(xué)性能，可確保微粒順利通過26號(hào)針而不斷裂。皮下注射實(shí)驗(yàn)表明，RSF微粒在隨后的2個(gè)月內(nèi)在該部位形成持久的隆起。組織切片證實(shí)，這些微顆粒沒有明顯降解，并且在微顆粒周圍形成血管。這些數(shù)據(jù)表明，這是一種簡(jiǎn)便的方法，以獲得有前途的基于RSF的注射填充物。
原文鏈接：
https://doi. 10.1039/d3bm01488f
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