研究背景
模仿細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重要特征的納米纖維支架，為組織再生提供了一種有前途的策略。在本文中，研究者開發(fā)了一種由天然蠶絲蛋白納米纖維（SNFs）和糖胺聚糖透明質(zhì)酸（HA）組成的仿生納米纖維支架。SNFs可以大規(guī)模組裝成密度低、形狀理想的納米纖維氣凝膠支架，HA的存在顯著提高蠶絲納米纖維的親水性和生物活性，使其具有超高孔隙率、自然生物活性和水環(huán)境中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。蠶絲納米纖維支架還模仿了ECM的層次結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞的粘附和增殖提供了有利的微環(huán)境，這種在結(jié)構(gòu)和功能上仿生的系統(tǒng)是一種很有前途的組織工程支架。
研究內(nèi)容
在這項(xiàng)研究中，受ECM獨(dú)特結(jié)構(gòu)和生物活性組成的啟發(fā)，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種由SNF和HA組成的結(jié)構(gòu)和功能仿生氣凝膠支架，并展示了它們?cè)谏镝t(yī)學(xué)應(yīng)用中的潛力。研究結(jié)果表明，該支架可在蛋白酶/透明質(zhì)酸酶溶液中保持其整體形狀。此外，SNF氣凝膠支架表現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性和細(xì)胞浸潤性。這些在結(jié)構(gòu)和功能上仿生生物材料拓展了SNFs的應(yīng)用場景，使其適用于濕法應(yīng)用，例如用于細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程的3D基質(zhì)。
圖1 HA組裝的SNF氣凝膠支架的制備和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性
機(jī)械分解后均勻的SNF漿料（圖1B）通過冷凍干燥得到低密度SNF支架，并且可以很容易地制造出理想的形狀（圖1C）。而這種支架在蒸餾水中浸泡后，迅速膨脹并失去其原始形狀，在水環(huán)境中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差（圖1I)。
為了提高SNF支架的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和力學(xué)性能，采用HA調(diào)控SNF裝配。將SNFs和HA混合，通過EDC交聯(lián)和冷凍干燥制備3D納米纖維氣凝膠支架。SNF支架在浸入水中時(shí)保持了結(jié)構(gòu)完整性和原始形狀，表明SNFs之間的相互作用增強(qiáng)。HA大分子的?COOH基團(tuán)可以與蠶絲納米纖維表面氨基（?NH2）形成酰胺鍵（?CONH?）（圖1D、E）。通過化學(xué)交聯(lián)，將HA大分子接枝到SNFs的表面。此外，HA鏈之間酯基的形成將進(jìn)一步增強(qiáng)SNF氣凝膠在水中的穩(wěn)定性。
為了進(jìn)一步探究HA組裝的SNF氣凝膠支架在水環(huán)境中的穩(wěn)定性，將其置于PBS中，支架可以保持整體形狀13周，顯示出優(yōu)異的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在蛋白酶/透明質(zhì)酸酶溶液中，SNF 氣凝膠在 2 周后仍保持其整體形狀。添加了10.0% HA的SNF支架能夠在蛋白酶/透明質(zhì)酸酶系統(tǒng)中保持結(jié)構(gòu)完整性3周（圖1J）。SNF支架在蛋白酶/透明質(zhì)酸酶溶液中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性為其在體內(nèi)應(yīng)用提供了可行性。
圖2 HA修飾對(duì)SNFs的影響
為了檢測HA是否成功化學(xué)接枝到納米纖維表面，以及HA功能化對(duì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞行為的影響，研究了SNF膜的接觸角和細(xì)胞活力。將以不同量HA改性的SNFs徹底沖洗并制備成膜（圖2A）。HA修飾后的SNF膜的接觸角顯著減小，表明HA已成功化學(xué)接枝到納米纖維表面（圖2C）。當(dāng)反應(yīng)溶液的HA比達(dá)到SNF重量的10.0%時(shí)，接觸角沒有顯著變化，表明達(dá)到最大接枝含量。
采用CCK-8試劑盒和熒光染色檢測細(xì)胞活力。如圖2D，修飾后的SNF膜表面細(xì)胞表現(xiàn)出快速增殖，表明其優(yōu)異的生物相容性。改性SNF膜的細(xì)胞粘附和增殖顯著高于純SNF膜。圖2E顯示了BMSCs在不同SNF薄膜上的熒光圖像。在SNF膜的表面，細(xì)胞顯示出完全擴(kuò)散。用10.0% HA修飾的SNF膜上的細(xì)胞擴(kuò)散似乎比其他兩組更強(qiáng)，表明HA含量對(duì)細(xì)胞生長的積極影響。
圖3 HA組裝的SNF氣凝膠支架的結(jié)構(gòu)表征
研究團(tuán)隊(duì)還探索了HA比率對(duì)SNF支架形貌、孔隙率和比表面積的影響。圖3結(jié)果表明，凍干的SNF海綿呈現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)，孔徑范圍為100-300μm（圖3A-D）。HA添加后，納米纖維形貌未被破壞，SNFs組裝成蓬松的納米纖維狀ECM樣結(jié)構(gòu)。隨著HA比率增加，孔隙率下降。由于超低的納米纖維濃度（0.5 % SNF漿料），2.5 %-10.0 %的HA比例對(duì)SNF支架的密度和孔隙率的影響較弱。使用BET進(jìn)一步測量SNF支架的比表面積。如圖所示圖3F，HA比率的增加，比表面積逐漸減小。當(dāng)HA比值從5.0 %提高到10.0 %時(shí)，比表面積僅略有減少，維持117 m2/g。SNF支架的水結(jié)合能力通過溶脹率和水保留率來檢測。SNF支架的水結(jié)合能力隨著HA比值的增加而增加（圖3G，H）。在天然ECM中，糖胺聚糖為細(xì)胞提供類似水凝膠的微環(huán)境。HA極大地提高了SNF支架的親水性和水結(jié)合能力，可以為改善細(xì)胞生長和組織再生提供高度水合的微環(huán)境。
圖4 HA組裝的SNF氣凝膠支架的機(jī)械性能
采用壓縮試驗(yàn)檢測HA添加量對(duì)SNF支架力學(xué)性能的影響。圖4顯示了納米纖維支架的可壓縮性。在被壓縮500倍于自身重量后，SNF氣凝膠恢復(fù)到其原始形狀（圖4A）。與再生絲素蛋白納米纖維相比，天然SNFs保留了天然絲的原始分層結(jié)構(gòu)和高機(jī)械性能。HA的加入通過增強(qiáng)SNFs之間的相互作用，顯著提高了復(fù)合材料支架的力學(xué)性能（圖4B-E）。隨著 HA 從 2.5 %增加到 10.0 %，壓縮強(qiáng)度從 11.1 kPa在 80 % 應(yīng)變下增加到 13.9 kPa，SNF支架的模量也相應(yīng)增加（圖4G)。
水合氣凝膠支架在80 %應(yīng)變下的水下壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線如下圖4H。HA組裝的SNF氣凝膠支架可以承受較大的壓縮應(yīng)變，在水環(huán)境中不會(huì)出現(xiàn)任何裂紋。隨著HA比率增加，80 %應(yīng)變下的壓縮強(qiáng)度和模量也呈增加趨勢(shì)（圖4I,J）。上述結(jié)果表明，添加少量HA不僅賦予了SNF氣凝膠在水中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，而且增強(qiáng)了其力學(xué)性能。
圖5 HA組裝的SNF氣凝膠支架上的細(xì)胞活力
采用CCK-8試劑盒和熒光染色檢測成骨細(xì)胞（圖5B）活力。接種一天后，細(xì)胞在3D支架內(nèi)實(shí)現(xiàn)了良好的細(xì)胞粘附和存活。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，支架內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量增加，第7天（圖5D）熒光圖像表明，SNFs能夠支持細(xì)胞的粘附和快速增殖。
總結(jié)與展望
在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種由蛋白質(zhì)納米纖維和糖胺聚糖組成的仿生納米纖維支架。納米纖維氣凝膠支架表現(xiàn)出超低密度、超高孔隙率和帶有微孔的孔壁結(jié)構(gòu)，有利于傳質(zhì)，實(shí)現(xiàn)有效的營養(yǎng)供應(yīng)、氧擴(kuò)散和代謝廢物清除。納米纖維氣凝膠支架不僅模仿了ECM的組成，而且模仿了ECM的層次結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞的粘附和增殖提供了有利的微環(huán)境?？梢灶A(yù)見，這種在結(jié)構(gòu)和功能上仿生的系統(tǒng)可以作為優(yōu)越的組織工程生物醫(yī)學(xué)材料。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.128762
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