摘要
蠶絲納米原纖維(Silk nanofibrils,SNFs)是從蠶絲中提取的一種高潛力的蛋白質(zhì)納米纖維材料，其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用尚未開發(fā)。在這項研究中，開發(fā)了一種具有細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)模擬結(jié)構(gòu)和高比表面積的SNF組裝微球。通過全水處理從蠶絲中剝離SNFs，并將其用作構(gòu)建微球的基石。受ECM的結(jié)構(gòu)和生物活性成分的啟發(fā)，透明質(zhì)酸(HA)被用作生物膠來調(diào)節(jié)SNF的組裝。在透明質(zhì)酸的輔助下，采用電噴法制備了具有穩(wěn)定蓬松結(jié)構(gòu)的SNF微球。該微球具有良好的生物相容性和誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的能力。作為多功能性的證明，SNF微球與其他分子和納米材料進(jìn)一步功能化。利用SNF微球優(yōu)異的血液相容性和從分子水平到納米尺度的可修飾性的優(yōu)勢，我們展示了它們在蛋白酶檢測和血液凈化方面的廣泛應(yīng)用?；谶@些結(jié)果，我們預(yù)見這種天然絲基納米纖維微球可以作為一種優(yōu)越的生物醫(yī)學(xué)材料用于組織工程、早期疾病診斷和治療設(shè)備。
一、SNF微球制備
下圖展示了SNF微球的制備過程和形貌。SNF是通過化學(xué)預(yù)處理和機(jī)械分解從天然絲中分離出來的。所得SNF的直徑分布在50-850nm之間，平均直徑約為~300nm。納米纖維的長度達(dá)到100μm以上，具有較高的長徑比。
將提取的SNFS作為基塊，通過電噴涂法制備納米纖維微球。將SNF分散體與透明質(zhì)酸(HA)水溶液混合，在靜電場下噴灑到液氮中，然后冷凍干燥形成多孔微球。雖然SNF是分層微球的理想候選骨架，但由于溶液粘度不足，SNF懸浮液很難單獨噴射成均勻的球形顆粒。HA是一種帶負(fù)電荷的線性糖胺聚糖，在ECM中起著關(guān)鍵作用。我們利用生物活性HA促進(jìn)SNF微球的形成。透明質(zhì)酸可以提高粘度，形成均勻分化的微球液滴。含有10% HA的凍干SNF微球具有規(guī)則的球形形態(tài)和蓬松的納米纖維ECM樣結(jié)構(gòu)。制備的微球直徑在500~1350 μm之間，平均直徑約為900 μm。
添加10% HA的SNF微球在水中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，說明HA的加入賦予了納米纖維微球在水中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在微球制備過程中，HA大分子與SNFS之間形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。EDC交聯(lián)HA作為生物膠結(jié)合SNF，提高了微球在溶劑中的穩(wěn)定性。交聯(lián)劑和HA的引入對絲納米纖維的結(jié)構(gòu)沒有明顯的影響。
圖1 SNF微球的制備工藝及結(jié)構(gòu)
二、SNF微球表征
HA添加量低于5%時，由于粘度不足，只形成了坍塌的微粒。加入5%以上的HA后，SNF懸浮液可以被電噴涂成微球，當(dāng)HA達(dá)到20%時，大部分微球仍能保持球形形態(tài)。然而，由于過量HA的存在，微球表面變得更致密。當(dāng)HA含量過多時，納米纖維之間的“點狀附著”會轉(zhuǎn)變?yōu)椤澳罡街?，?dǎo)致微球表面形成層狀結(jié)構(gòu)。
微球在水中表現(xiàn)出很高的穩(wěn)定性，即使在PBS中浸泡30天后也是如此。微球的膨脹率和保水率隨著HA含量的增加而增加，這歸因于HA的超親水性。透明質(zhì)酸的引入大大提高了SNF微球的親水性和水結(jié)合能力，有利于微球作為細(xì)胞載體和支架。相反，隨著HA含量的增加，孔隙率和比表面積顯著降低，因為HA占據(jù)了納米纖維之間的空間。綜上所述，含10% HA的微球為作為后續(xù)實驗的優(yōu)化組。SNF/HA10%微球的比面積比SF/HA10%微球增加了5倍以上，表明SNF/HA10%微球在用作細(xì)胞載體或組織工程支架時具有潛在的高吸附性和負(fù)載能力。
圖2 SNF微球的表征
三、SNF微球的細(xì)胞培養(yǎng)與分化
研究了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在SNF微球上的增殖情況，并將其與含10% HA的再生SF海綿進(jìn)行了比較。微球和多孔海綿均支持干細(xì)胞的長期生長和持續(xù)增殖。有趣的是，SNF微球上的細(xì)胞活力值高于多孔海綿，表明SNF微球具有更好的細(xì)胞相容性。進(jìn)一步，在微球上評估骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化行為。SNF微球和多孔海綿均能支持成骨分化誘導(dǎo)下的細(xì)胞生長骨特異性標(biāo)記物的表達(dá)，成骨標(biāo)志物ALP、Runx2.Col和OCN這些基因在第7天SNF微球上的表達(dá)水平高于多孔海綿，表明SNF微球?qū)Τ晒欠只恼T導(dǎo)作用增強(qiáng)。
圖3 SNF微球的細(xì)胞培養(yǎng)與分化
四、SNF微球在分子診斷和血液凈化上的應(yīng)用研究
用于胰蛋白酶活性監(jiān)測的特異性肽首次移植到SNF微球上用于血液分子診斷。通過控制多肽的初始濃度來調(diào)節(jié)多肽接枝率。隨著多肽濃度逐漸增加到0.8mg/mL，熒光強(qiáng)度和硫含量增加，表明修飾成功，多肽接枝率增加。
在0-15 nM濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與蛋白酶濃度之間存在明顯的線性關(guān)系。當(dāng)濃度達(dá)到60nM時，熒光強(qiáng)度達(dá)到平臺。微球的檢出限(LOD)為11.4pM，具有良好的靈敏度。SNF微球的三維納米纖維結(jié)構(gòu)和極高的比表面積極大地改善了被檢測分子與接枝肽的相互作用，從而對胰蛋白酶檢測具有很高的靈敏度。
下圖展示了碳納米管功能化SNF微球的制備過程。將SNF/HA溶液與羧化CNTS充分混合后，可通過電噴涂形成均勻的復(fù)合微球。CNTS緊密附著在紅細(xì)胞表面，表明CNTS對紅細(xì)胞具有很大的風(fēng)險。結(jié)果表明，CNTS具有明顯的溶血作用，溶血度為8%，而SNF和SNF基微球的溶血度<4%，低于5%的安全值。
圖4 用于分子診斷和血液凈化的SNF微球功能化研究
結(jié)論
綜上所述，我們報道了一種由天然絲納米纖維組成的仿生微球，并展示了其在生物醫(yī)學(xué)上的廣泛應(yīng)用。在生物活性多糖HA的幫助下，SNFs可以被電噴涂成具有三維蓬松非纖維結(jié)構(gòu)的微球?；谏镌葱曰瘜W(xué)成分和仿生納米纖維結(jié)構(gòu)，SNF微球具有良好的生物相容性和促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的能力，具有作為細(xì)胞載體和組織工程微支架的巨大潛力。為了證明SNF微球的多功能性，制備了多肽修飾的SNF微球和碳納米管功能化的SNF微球，并評估了它們在蛋白酶檢測和血液凈化方面的優(yōu)異性能。SNF微球制備簡便，具有良好的生物相容性和廣泛的應(yīng)用前景，有望推動天然絲納米纖維在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。
文章信息
Yan S, Wang L, Fan H, et al. Biomimetic Natural Silk Nanofibrous Microspheres for Multifunctional Biomedical Applications. ACS Nano.2022;16(9):15115—15123.doi:10.1021/acsnano.2c06331
通訊作者簡介
張瑩瑩，清華大學(xué)化學(xué)系教授，博士生導(dǎo)師，截止2022年4月，發(fā)表SCI論文143篇，其中93篇以通訊作者發(fā)表，包括Nature Nanotechonolgy， Nature Communucations, Science Advances, PNAS, Matter,JACS，Advanced materials，ACS Nano,Nano Letters,等。 獲授權(quán)發(fā)明專利18項。出版專著一本，參著書籍兩本。在國內(nèi)外學(xué)術(shù)會議做邀請報告40余次。 研究成果曾被Nature、Nature Nanotechnology、C&EN、PHYS ORG、Scientific American、NanotechWeb、Nanowerk、人民日報、科技日報等專題報道。主要研究方向：納米碳材料與絲蛋白材料的制備、性能與應(yīng)用；柔性可穿戴器件及其在生命健康和信息領(lǐng)域的應(yīng)用；功能纖維與智能織物的設(shè)計、制備與應(yīng)用。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1021/acsnano.2c06331
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